Práctica 9. Cromatografía columna HbA1c

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1. OBJETIVO

Determinación  hemoglobina glicosilada (HbA1c).

2. FUNDAMENTO

La prueba de hemoglobina glicosilada (HbA1c) es un examen de sangre para la diabetes tipo 2 y prediabetes. Mide el nivel promedio de glucosa o azúcar en la sangre durante los últimos tres meses. Los médicos pueden usar la prueba HbA1c sola o en combinación con otras pruebas de diabetes para hacer un diagnóstico. También utilizan la HbA1c para ver lo bien que está manejando su diabetes. Esta prueba es diferente a los controles de azúcar en la sangre que las personas con diabetes se hacen todos los días.
El resultado de su prueba HbA1c se entrega en porcentajes. Mientras más alto sea el porcentaje, mayor es su nivel de azúcar en la sangre:
  • Un nivel de HbA1c normal es menor al 5,7 por ciento
  • La prediabetes se ubica entre 5,7 a 6,4 por ciento. Tener prediabetes es un factor de riesgo para desarrollar diabetes tipo 2. Las personas con prediabetes pueden necesitar repetir las pruebas cada año
  • La diabetes tipo 2 se ubica por encima del 6,5 por ciento

3. MATERIALES

  • Papel de filtro
  • Columna de cromatografía
  • Muestra de sangre 
  • Micropipetas
  • Puntas de micropipeta
  • Gradilla
  • Dos tubos de ensayo
  • Portacubetas
  • Cubetas

4.PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar encendemos el espectrofotómetro a 415 nm.
2. Añadimos 50µL de sangre total con EDTA/hepar y 200µL del reactivo 1 (R1) en un tubo de hierro.
 

3. Agitamos para hemolizar.
4. Dejamos reposar 10 minutos.
5. Destapar la columna y quitar la parte inferior. Bajar el disco hasta que toque la resina. 
6. Dejar gotear y desechar el eluido.
7. Añadimos 50µL de hemolizado en la columna. Desechamos eluido.
8. A continuación, añadimos 200µL de reactivo 2 en la columna y desechamos el eluido.
9. Una vez realizado lo anterior, añadimos 2 mL de R2 en la columna y desechamos eluido.

10. Colocamos la columna en un tubo. Añadimos 4mL R3 y recogemos el eluido donde se encontrará la HbA1c.
11. En un tubo de ensayo incorporamos 12mL de R3 y 50µL de hemolizado. 
12. Agitamos y medimos absorbancia.

5.ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Blanco: 0 A
Patrón: 0'162 A
Muestra: 0'065 A
  
Los valores normales se encuentran 4,2-6,2 %.
Teniendo en cuenta el resultado obtenido, este es alto porque es posible que los reactivos estuviesen caducados o la sangre muy degradada.

6.OBSERVACIONES

Hay que prestar atención al instrumental eléctrico y realizar la técnica con la mayor precisión posible.

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