Práctica 6. Cromatografía en capa fina

1. OBJETIVO

Realizar una separación e identificación de los aminoácidos (L-arginina, Ác. glutámico y L-fenilalanina) mediante una cromatografía de capa fina ascendente.

2. FUNDAMENTO

La cromatografía de capa fina consta de un soporte que es plano y consiste en una capa muy fina de partículas (gel de sílice, celulosa, poliaminas, gel de silicato magnésico, etc.) situadas sobre una lámina de vidrio, plástico o aluminio.

 La fase móvil es un líquido adecuado a las sustancias a separar, mientras que la fase estacionaria está representada por las partículas depositadas sobre el soporte (cromatografía L/S). 

La muestra se coloca sobre el soporte, se deja secar y, tras la introducción del conjunto en la cámara cromatográfica, será arrastrada por la fase móvil de una manera similar a la de la cromatografía sobre papel.

 El movimiento de la fase móvil puede ser ascendente o descendente, igual que en el caso anterior. El mecanismo de separación es del tipo de la adsorción. La detección puede hacerse utilizando luz UV o colorantes  y la cuantificación se basa en métodos de elución  o métodos fotodensitométricos.

La relación al frente del solvente (Rf) se define como la relación existente entre la distancia desde el punto de aplicación a la mancha (dm) y la distancia desde el punto de aplicación al frente del solvente (ds):

3.MATERIALES

• Lámina de gel de celulosa
• Disolvente de cromatografía
• Disolución reveladora(resuspender la ninhidrina en acetona a una concentración de 0'2% p/v)
• Muestra problema de aminoácidos(Leu+Ala+Gly)
• Muestras patrón de aminoácidos
• Cubeta o vaso de precipitado
• Micropipeta
• Vidrio de reloj
• Atomizador

4.PROCEDIMIENTO

1. Colocamos el disovente en el vaso de precipitados de forma que cubra el fondo hasta una altura máxima de 1cm y lo tapamos con un vidrio de reloj.

2. Coger por los bordes y con guantes una placa de gel de celulosa de 20·20cm.3. Con un lápiz marcar los puntos donde se aplicarán las muestras. Estos puntos deben estar a 1'5cm de la base y separados entre si 1cm.

4. Aplicar 2μ de la muestra y patrones de aminoácidos apoyando suavemente la punta de la micropipeta sobre el punto señalado en la celulosa. Esta operación debe hacerse aplicando y secando la misma muestra varias veces, para evitar una excesiva superficie del punto de aplicación.

5. Una vez que las manchas se hayan secado, introducir la placa verticalmente en la cubeta de forma que las muestras que queden en la base de la cubeta.

6. Poner la tapa y dejar que el disolvente suba por capilaridad durante aproximadamente una hora.
7. Cuando el frente haya subido aproximadamente 8cm, sacar la placa del vaso de precipitado, marcar el frente con un lápiz y secar al aire.

8. Con la placa seca y de forma vertical, pulverizar con el revelador de ninhidrina. La pulverización debe hacerse uniforme y suavemente.
9. Calentar la placa uno o dos minutos a 105ºC en una estufa. Las manchas de los aminoácidos de color rosáceo aparecerán distribuidas a lo largo del gel.

5.ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Una vez calentada la placa, al sacar ésta de la estufa pudimos observar la migración de ciertas sustancias en una fase móvil(disolvente) y una fase estacionaria(gel).

A continuación, medimos el frente del disolvente y las distancias desde la línea hasta el punto medio de cada aminoácido (en la muestra). 

Apuntamos resultados:

• La distancia desde la línea hasta el punto medio de cada aminoácido es del primero empezando por abajo es de 1 cm, el segundo de 2'4 cm y el tercero de 3'8cm.
• La distancia del frente de solvente es de 6 cm.

Nuestros compañeros realizaron una cromatografía en tres puntos con los aminoácidos arginina, fenilalanina y ácido glutámico aislados con el objetivo de comparar nuestros resultados con los valores reales de los aminoácidos.

Al relacionar su lámina control con la lámina de la muestra observamos que la primera mancha se trataba del aminoácido fenilalanina (2'4 cm) y la segunda ácido glutámico (3'8 cm). 
Por tanto,llegamos a la conclusión de que en la muestra no hay presencia de arginina.

6.CONDICIONES DE SEGURIDAD Y OBSERVACIONES

No se debe tocar sin guantes la lámina de celulosa, ya que las partículas que contienen son tóxicas y además se debe coger por los bordes ya que las huellas de los dedos podrían aparecer después como confusas manchas coloreadas.

Otra cosa muy importante es el uso de la ninhidrina. Esta debe ser usada en un lugar abierto, con guantes y mascarilla debido a su alto nivel de corrosividad, a una distancia no muy lejos de la lámina y realizando una primera pulverización de prueba lejos de cualquier contacto a alguien. Y en caso de contacto se debe aplicar gran cantidad de agua sobre la zona dañada. Debe evitarse el exceso de pulverización.